不帶MALS的HPLC,你還在讓蛋白聚體分析裸奔嗎?

來源: 北京百普賽斯生物科技有限公司   2020-4-3   訪問量:1270評論(0)

作為抗體藥物開發的關鍵試劑,重組蛋白抗原貫穿抗體藥物研發的前期免疫、抗體篩選和鑒定、抗體藥物候選物體內體外功能驗證、抗體藥物質量控制以及臨床樣本分析等過程,而重組蛋白的質量和活性一定程度上直接決定了抗體藥物研發的成敗和周期。

重組蛋白抗原需要盡可能保持和天然蛋白一致的正確折疊和構象,從而保證蛋白抗原的天然活性,同時具有最小的批間性能差異,幫助提高藥物開發成功率。

蛋白結構決定活性和功能

蛋白質的結構決定其功能和活性,而重組蛋白在溶液中的聚集狀態、二硫鍵的正確配對與否,翻譯后修飾等理化性質是蛋白正確結構的基礎,在重組蛋白產品的設計、表達和生產過程中應該嚴格加以控制。

蛋白在溶液中的聚集狀態,是保證蛋白正確結構的重要基礎性質之一,需要重點關注。天然蛋白在體內往往以一定的天然聚集狀態和構象的形式存在,發揮其正確的生物學功能,而重組蛋白在生產過程中產生的隨機不正確聚集常常會引起某些關鍵功能表位構象或暴露程度的改變,導致無法獲得針對天然有效表位的高質量抗體候選物,影響抗體藥物體外功能驗證等結果,顯著降低抗體藥物開發的成功率。

舉例來說,天然的FGL1蛋白以共價二聚體形式存在,N端的Cys26會形成一對肽鏈間二硫鍵幫助其維持正確的穩定結構。重組FGL1表達生產過程中,如果人為去除Cys26,FGL1的表達量會明顯提高,但FGL1將無法形成共價二聚體,對所得到的FGL1蛋白的功能產生較大影響。

ACROBiosystems生產的FGL1蛋白保留了Cys26,最大程度維持其天然構象不變,可形成正確的鏈間二硫鍵,經BLI測定,FGL1和LAG-3親和力常數為13.6nM(圖1. a),與文獻報道的28nM非常接近[1];而人為去除鏈間二硫鍵的FGL1蛋白和LAG-3的親和力常數僅為0.27μM(圖1. b),比文獻報道偏低10倍。且去除二硫鍵的FGL1蛋白的聚集狀態、穩定性等各方面性質和天然二聚體FGL1蛋白有明顯差異(data not shown)。因此,人為引入的蛋白結構變化會顯著增加抗體藥物開發的不確定性。

圖1. 不同FGL1蛋白和LAG-3的BLI親和力分析

蛋白在正確的聚體結構下才能有效激活下游通路,發揮其生理功能。比如,在調控免疫應答過程中發揮重要作用的TNF超家族,該系列蛋白在天然狀態下為三聚體結構,只有三聚體形式TNF-α與TNFR1的胞外區結合,才能引起TNFR1的三聚化,進而有效的激發下游通路(圖2)引起細胞凋亡[2]。使用具有天然三聚體結構的蛋白免疫得到的抗體,在體內將能更好的識別天然抗原表位,有效的阻斷受體和配體的結合,達到預期的治療效果。

圖2. TNF-α與TNFR1的胞外區結合引起細胞凋亡的機制

可見,蛋白質的聚集狀態是決定其功能和活性的重要性質之一,應在重組蛋白抗原產品的設計、表達和生產過程中重點關注并嚴格加以控制,這就要求采用較為準確可靠的分子量測定分析技術來表征重組蛋白在溶液生理條件下的真實聚集狀態,指導重組蛋白抗原產品的研發設計、生產工藝優化和質量控制。

蛋白分子量分析技術:SEC-HPLC和MALS

蛋白分子量分析技術主要有:

1)基于SEC-HPLC(高效分子篩液相色譜)的保留時間內插估算法;

2)基于SEC-MALS(多角度激光散射)的分子量絕對定量法

兩種技術在原理上有一些異同點,如下表:

兩種技術均用到了SEC(Size Exclusion Chromatography, 體積排阻色譜)技術,SEC技術原理是蛋白樣品流經多孔的惰性色譜柱基質時對樣品進行分離,較小的分子進入填料孔內,滯留時間長,較大的分子被排阻在孔外可以隨流動相快速地通過色譜柱(圖3),因此可以利用分子篩對分子量大小不同的抗原蛋白進行分離。由于聚集形成不同大小的聚體,可利用分子篩對分子量大小不同的各組分而完成分離。

圖3. SEC技術工作原理

SEC-HPLC通常是先測定一系列已知分子量的球蛋白標準品(如Thyroglobulin,IgG, BSA等)的洗脫保留時間TR ,然后生成分子量計算標準曲線 (Log MW ~TR),用于蛋白分子量的測定。實驗中只要將待測蛋白的保留時間代入上述標準曲線,就可以快速計算得到分子量。但這種方法存在很多問題和局限性,比如實際實驗中測定得到的分子量往往和真實值相去甚遠,極大地影響了結果的判斷。這是因為SEC的基本原理是假定不同蛋白形狀一致,蛋白和填料之間沒有任何相互作用,蛋白洗脫體積只與SEC排阻性質有關,且洗脫體積可穩定重現。實際上,不同的蛋白具有不同的結構和形狀,相同分子量的不同蛋白在SEC排阻中性質往往不盡相同;不同蛋白表面疏水性存在差異,也會引起蛋白和柱子填料之間的非特異作用;另外柱子性能的變化、流動相的成分等也會顯著影響洗脫保留時間。這些因素導致SEC-HPLC測定結果和真實值存在較大差異,無法滿足準確測定蛋白分子量和聚集狀態的要求。

MALS技術(Multi-Angle Light Scattering)是基于蛋白的分子量與光散射的強度直接相關來測定蛋白絕對分子量的技術,無需使用標準蛋白,不依賴于洗脫保留時間,也就避免了SEC分子篩測定分子量的諸多問題[3]。SEC-MALS技術中,通過SEC分離后的各組分進入多角光散射檢測器,激光照射到分析物時會發生光的散射,MALS通過多個角度同時測定散射光的強度(圖4.a)。,從公式b1中(圖4.b1)可以看出散射光強度正比于摩爾質量、濃度、折光指數增量的平方,用公式b2(圖4.b2)可以直接計算出分析物的絕對分子量[4]。由此可見,MALS技術不依賴于蛋白的洗脫保留時間來計算蛋白分子量,因此測定結果較傳統的SEC-HPLC更加準確可靠。

我們用SEC-HPLC和MALS兩種方法分別測定了OKT3、赫賽汀(Herceptin)和伊匹單抗(Ipilimumab)三種已知分子量的上市抗體藥物。如表1所示,三種抗體藥物實際具有非常接近的分子量(150-160kDa),但三者洗脫保留時間卻有較大的差異,造成SEC-HPLC計算分子量大相徑庭,其中OKT3抗體測定為212.5kDa,Ipilimumab僅為66.3kDa,和真實分子量相去甚遠。而SEC-MALS檢測三種抗體分子量和抗體理論分子量非常接近(圖5-6)。

表1 三種抗體藥分子量測定結果

圖5. 不同抗體的SEC-HPLC分子量測定結果

圖6. SEC-MALS測定三種抗體藥物的分子量.a OKT3, b Herceptin, c Ipilimumab

可見,由于SEC-HPLC分子篩技術測定分子量對保留時間嚴重依賴,使用標準蛋白marker對比無法準確測定溶液中蛋白分子量和聚集狀態,成為高質量重組蛋白生產開發的限制因素。而SEC-MALS技術直接準確測定蛋白絕對分子量,不依賴于保留時間和marker,成為高質量重組蛋白生產開發和質量控制的必備技術手段。

經MALS驗證的TNF超家族三聚體活性蛋白

作為藥物開發用重組蛋白的行業工作者,ACROBiosystems針對抗體藥物開發的需求,使用SEC-MALS技術準確測定溶液中生理條件下蛋白分子量和聚集形式,推出新一代經過MALS分子量驗證的TNF超家族三聚體蛋白系列產品,具有更接近天然的折疊構象和正確的三聚體聚集狀態,產品性質更均一,批間差更小,活性經過ELISA、流式細胞,功能等應用場景的驗證,加速抗體藥物的開發。

以CD27 Ligand為例,CD27L屬于TNF超家族,主要表達于活化的T細胞、B細胞及成熟的DC細胞中,CD27L體內以天然三聚體形式存在,通過和其受體CD27之間的相互作用,促進T細胞和B細胞的活化、增殖及分化,在調控免疫應答過程中發揮重要的作用,是一種很有潛力的腫瘤生物治療靶點。

我們驗證了不同來源的CD27L重組蛋白的HPLC均一性、MALS分子量和活性。如表2所示,ACRObiosystems開發的CD27L(MALS verified)三聚體蛋白用SEC-HPLC上測定為均一的單峰,主峰純度達到86%以上,經MALS測定分子量為180.8kDa,確定為均一的天然三聚體。而其他兩個來源的蛋白,HPLC測定顯示均一性較差,產品中都含有聚集程度不一的不同組分,分別為347kDa的異常高聚體(含量69.7%)和含有多種不同聚集體的不均一混合物(圖7)。ELISA檢測CD27L和受體CD27的結合性質,ACRObiosystems生產的重組CD27 Ligand (MALS verified)蛋白和其配體CD27結合活性遠遠好于其他同類產品(圖8)。

圖7. 不同來源CD27L重組蛋白的MALS比較

圖8.不同來源CD27L蛋白的ELISA結合活性比較

表2. 不同來源重組CD27L Fc蛋白的性質比較

此外,ACRO還針對ELISA和流式細胞分析等實驗場景,開發了生物素標記的三聚體產品系列,經過細胞功能活性驗證(圖9)。同時免費提供實驗驗證protocol,進一步加速抗體藥物的開發。

圖9. a.CD27 Ligand(His Avi tag)蛋白的純度和分子量驗證,CD27L經SEC-HPLC測定其純度>90%,均一組分,MALS經分子量驗證為68.9kDa的三聚體. b.流式細胞實驗驗證.

結論

1. 蛋白質的結構決定其功能和活性,藥物開發用重組蛋白抗原應盡可能保持和天然蛋白一致的正確折疊和構象,從而保證蛋白抗原的天然活性。一般不建議人為改變重組蛋白的結構,避免給藥物的開發引入新的不確定性。

2. 蛋白的聚集狀態是決定其功能和活性的重要性質之一,在重組蛋白產品的設計、表達和生產過程中應該嚴格加以控制。

3. 傳統的SEC-HPLC技術因其自身諸多局限性,無法準確測定蛋白質分子量,給高質量藥物開發用重組蛋白的開發和質量控制帶來挑戰,影響了抗體藥物的開發。SEC-MALS技術具有準確度高,無需標準蛋白,不依賴于洗脫保留時間等優勢和特點,可以對蛋白絕對分子量進行直接準確測定,避免了SEC-HPLC的問題和局限。

4. ACRO新推出的MALS驗證的TNF超家族三聚體蛋白系列產品,經MALS驗證在溶液生理條件下具有正確的三聚體存在形式,更接近蛋白的天然構象,從而具有正確的蛋白功能活性。同時產品更均一,批間差更小,根本上避免了隨機高聚引起的批間差異大、親和效應和非特異背景信號等常見問題。

5. 作為藥物開發用重組蛋白抗原的行業引領者,ACRO基于對抗體藥物開發過程的深入理解,針對不同應用場景的需求來進行蛋白的產品開發和設計,最大程度減少隨意的人為結構干預,盡可能保持蛋白的天然狀態和構象,產品經過ELISA、流式細胞、功能實驗等多個維度不同分析應用場景的全面驗證,有助于降低抗體藥物開發的難度和不確定性。

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參考文獻:

[1] Wang, et al, Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3. Cell. 2019.

[2] Harper et al . Induction of TNF Receptor I-Mediated Apoptosis via Two Sequential Signaling Complexes. Cell. 2003.

[3] Paula et al. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2012.

[4] Some et al. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). Journal of Visualized Experiments. 2019.



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