干貨分享| 探討 rRNA去除的方法與必要性

來源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-4-3   訪問量:1518評論(0)

干貨分享| 探討 rRNA去除的方法與必要性

遺傳中心法則表明,DNA是生物體內遺傳信息的載體。遺傳信息在精密的調控下從DNA轉錄成RNA,再傳遞到蛋白質。因此RNA被認為是DNA與蛋白質之間生物信息傳遞的橋梁,在研究轉錄組信息中占有著重大的作用。

背景介紹

轉錄組(transcriptome)是指在某一特定的生理條件下,細胞、組織或者生物體內所有的轉錄產物的集合,即轉錄出來的所有RNA總和,包括編碼RNA(即mRNA)和ncRNAtRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA)等不同類型的RNA分子。在這之中核糖體RNA (rRNA) 約占RNA總量的 80%,是最多的一類RNA,通常這類RNA分子量比較大且代謝不活躍,種類包括:原核生物中5S rRNAs、16S rRNAs23S rRNAs三種,真核生物中5S rRNAs、5.8S rRNAs、18S rRNAs28S rRNAs四種。

1RNA分類圖

rRNA“作用”

隨著人類基因組計劃(HGP)和DNA元件百科全書計劃(ENCODE)的完成,人們發現在人類基因組中大部分DNA都可以轉錄成RNA,但是僅有1.5%的核苷酸序列用于蛋白質的編碼,剩余不編碼蛋白質的的非編碼RNAncRNA),被認為是基因組轉錄噪音。這種轉錄組噪音(無效信息)基本全部來源于豐度最高的成員——rRNA。

測序的目的就是為了更多的獲得生物信息,但是rRNA這個在RNA最豐富的成員卻只能提供非常少的轉錄本的信息,且檢測到過多的rRNA會掩蓋其它基因的表達豐富度;因此,通常在測序之前從RNA樣品中除去rRNA,rRNA去除的效率也被視為最大化讀取到轉錄物的關鍵因素。

2:人類組織或細胞總RNA中各種RNA分布餅狀圖

rRNA“去除法”

目前rRNA去除的方法主要有兩種,一種是通過DNA探針或者RNA探針雜交捕獲rRNA再用磁珠吸附去除的方法,這種方法稱為Ribo-Zero-seq;另一種利用雙鏈特異性核酸酶處理的方法提取mRNA,稱為DSN-seq。兩種方法對應的原理與區分如下所示:

方法一(DSN-seq

去除流程:特異性探針(區分物種)與rRNAs雜交——RNase H消化rRNAs——DNase I消化探針——其他RNA富集純化

市場占比:在市場現有品牌中占據絕大多數

優勢樣本起始量要求低;rRNA殘留量更低

缺點:其操作較復雜;暫無混合樣本效果驗證;

流程圖:

方法二(Ribo-Zero-seq

去除流程:生物素標記探針與rRNAs雜交——鏈霉親和素磁珠去除探針與rRNAs——其他RNA富集純化

市場占比:Illumina RiboZeroThermo RiboMinus系列使用該方法

優勢磁珠法,操作簡單;可應用于混合樣本;

缺點:樣本起始量要求高(一般為1 μg);rRNA殘留量相對方法1略高;

流程圖:

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rRNA“高效去除”

Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)利用RNase H消化法去除人、小鼠、大鼠總RNA中的核糖體RNA。該試劑盒對于完整和部分降解的總RNA(如FFPE RNA)均具有良好的rRNA去除效果。可用于高通量測序分析mRNA和非編碼RNA,也可用于cDNA合成或其它下游應用。

31μg 293T RNA 進行 rRNA 去除,利用 qPCR 對比去除前后 rRNA 基因和 mRNA 基因的Ct值變化(左圖)

分別以1μg 人、小鼠、大鼠總RNA為樣本,試劑盒去除rRNA后建庫,測序獲得rRNA殘留%數據(右圖)

產品信息:

產品名稱

貨號

規格

促銷格(元)

Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)

12253ES08

8T

2530

12253ES24

24T

9090

12253ES96

96T

29890

參考文獻:

1. Adiconis X , Borges-Rivera D , Satija R , et al. Corrigendum: Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples[J]. Nature Methods, 2014, 11(2):210-210.

2. Zhao W , He X , Hoadley K A , et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling[J]. Bmc Genomics, 2014, 15(1).

3. Petrova O E , Garcia-Alcalde F , Zampaloni C , et al. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes[J]. Scientific Reports, 2017, 7:41114.



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