技術貼——如何應用酶標儀助力病毒研究

來源: 北京昊諾斯科技有限公司   2020-4-3   訪問量:1637評論(0)

酶標儀可以做啥?

 

ELISA,核酸蛋白定量,抗原抗體分析,酶動力學,細胞活性分析,分子間相互作用, 內毒素檢測……

 

今天要給大家分享的是酶標儀用于Pseudovirus entry assays偽病毒進入分析。

最近Alexandra C. Walls等1在Cell發表了一篇文章。文章表明SARS-CoV-2作為一種新近出現的病原體,與人ACE2具有高親和力,并將其作為入侵靶細胞的受體。同時證明了SARS-CoV S鼠多克隆抗體有效地抑制了SARS-CoV-2 S介導的進入細胞,這表明接種疫苗后可以誘導產生靶向中性S抗原決定簇的交叉中和抗體。為疫苗和治療劑的設計提供了藍圖。

 

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Pseudovirus entry assays偽病毒進入分析實驗流程如下:

在10%FBS,1%PenStrep DMEM培養基中培養VeroE6和BHK細胞。將BHK或VeroE6細胞以0.3×106的密度接種到12孔板中培養16小時。部分BHK細胞不進行轉染,另一部分BHK細胞采用lipofectamine 2000(ThermoFisher)的標準方案,每孔用0.8μg ACE2轉染,再孵育16小時。用DMEM洗滌3次后,向孔中加入20uL濃縮的假病毒。2-3小時后,將含有20%FBS和2%PenStrep的DMEM加入細胞中培養48小時。感染48小時后,將One-Glo-EX以相同的培養體積添加到細胞中,并在黑暗中孵育10分鐘,然后在Varioskan LUX多功能酶標儀(ThermoFisher)上進行數據讀取。對于進入抑制分析,在室溫下將1:100稀釋的血漿與等量的假病毒孵育30分鐘,然后添加標準化量的假病毒到細胞中感染細胞。一式三份進行測量,并繪制相對熒光素酶信號(RLU)圖形。

 

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圖1. ACE2是SARS-CoV-2 S的功能性受體

(A)用SARS-CoV-2 S,SARS-CoV S和SARS-CoV-2 Sfur / mut假型的MLV的進入VeroE6細胞。數據表示為平均值±三次技術重復的標準偏差。
(B)用SARS-CoV-2S或SARS-CoV-2Sfur / mut假型的MLV進入hACE2瞬時轉染的BHK細胞中。用兩種獨立的假病毒制劑進行實驗,并顯示了其代表性實驗。數據表示為平均值±三次技術重復的標準偏差。

 

結果表明

研究使用鼠白血病病毒(MLV)假分型系統S介導進入靶細胞的功能決定因素(Millet and Whittaker,2016)。為了評估SARS-CoV-2 S促進進入靶細胞的能力,研究者首先比較了SARS-CoV-2 S-MLV和SARS-CoV S-MLV向VeroE6細胞的轉導,已知這些細胞表達ACE2和支持 SARS-CoV復制(Drosten et al., 2003; Ksiazek et al., 2003)。兩種假病毒均能很好地進入細胞(圖1A),這表明SARS-CoV-2 S-MLV可以使用非洲綠猴ACE2作為進入受體。為了證實這些結果,研究者評估了進入BHK細胞的過程,并觀察到hACE2的瞬時轉染使其易于被SARS-CoV-2 S-MLV轉導(圖1B)。這些結果表明,hACE2是SARS-CoV-2的功能性受體,與最近報道的發現一致(Hoffmann et al., 2020; Letko et al., 2020; Zhou et al., 2020)。

 

另一篇是Young-Jun Park等2發表在Nature Structural & Molecular Biology上的文章。中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)會導致人類嚴重的甚至致命的呼吸道疾病,因此沒有疫苗或特定的治療方法。研究表明通過識別一個保守的溝槽,該溝槽對于MERS-CoV S介導的唾液酸化物進入人體氣道上皮細胞至關重要。其數據闡明了MERS-CoV S唾液苷的特異性,并表明與α2,6-連接的受體相比,對α2,3-連接的選擇性是與前一類寡糖相互作用增強的結果。本研究提供了一個結構框架,說明MERS-CoV附著于唾液酸苷受體,并識別抑制病毒進入的潛在脆弱性位點。

 

Pseudovirus entry assays偽病毒進入分析實驗流程如下:

制備MERS-CoV S假型的鼠白血病病毒。使用Lipofectamine 2000或3000轉染試劑按照制造商的說明使用(ThermoFisher),將HEK293T / 17細胞與全長MERS-CoV S或MERS-CoV S突變體編碼質粒,鼠白血病病毒Gag-Pol包裝構建體以及編碼熒光素酶報告基因的鼠白血病病毒轉移載體共轉染。用轉染培養基將細胞在37°C和8%CO2下孵育5–12小時。然后將細胞用DMEM洗滌兩次,并加入含有10%(vol / vol)FBS的DMEM培養達72小時。然后收集上清液,并通過0.45μm膜過濾,然后用30 kDa離心濃縮器膜(Amicon)濃縮。

 

胰蛋白酶消化后,將含有10%(vol / vol)FBS和1%(vol / vol)PenStrep的DMEM中生長的Calu-3細胞以每毫升〜3.2×104個細胞的密度接種到96孔板中,使其生長。在37°C下以8%(vol / vol)的CO2進行48小時。將細胞用DMEM洗滌3次,添加40μl MERS-CoV S或MERS-CoV S突變型假病毒于37°C,8%(vol / vol)CO2的條件下培養2h。溫育2小時后,將40μl的20%(vol / vol)FBS和2%(vol / vol)PenStrep加入孔中,并將板溫育72小時。以等體積添加ONE-Glo-EX(約75μl,以解決蒸發),并在Varioskan多功能酶標儀上讀取熒光素酶信號數值。

 

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圖3 配體結合位點是MERS-CoV S介導的唾液酸內分泌并進入人氣道上皮細胞的必需位置。
b,MERS-CoV S F39A,H91A,S133A或R307A突變抑制了假型鼠白血病病毒顆粒進入人氣道Calu-3細胞。相對于野生型將數據標準化,并顯示為平均值和標準差。n = 3個偽病毒實驗(技術重復)。

 

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Extended Data 5 | SDS-PAGE和蛋白質印跡分析。

b,使用抗MERS-CoV S1多克隆抗體對用野生型或突變體MERS-CoV S假型化的鼠白血病病毒顆粒進行Western印跡分析。未裁剪的污點圖像可用作源數據。

 

結果表明

由于分別破壞涉及Neu5Ac C1羧酸鹽和甘油側鏈的上述靜電相互作用,S133A和R307A突變體消除了假型病毒顆粒的進入(圖3b和Extended Data圖5b)。F39A和H91A突變體顯示假型顆粒的傳染性降低了90%以上,這可能是由于配體結合凹槽的破壞和有利的范德華力或靜電相互作用的喪失(圖3b和擴展數據圖5b)。

 

Varioskan LUX多功能酶標儀

 

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應用領域

傳染病,毒理學,免疫學,神經生物學,癌癥研究,基因編輯,干細胞生物學等

 

對研究人員/臨床研究實驗室的好處

● 研究藥物,病毒制劑和其他探針對細胞,蛋白質檢測和定量的影響

準確的NA定量

● 快速分析大量樣品

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